Cystein mildert die Wirkung der NaCl-Salztoxizität in Flachspflanzen (Linum usitatissimum L), indem es die Antioxidationssysteme moduliert

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 11359 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Landwirtschaft, der größte wasserverbrauchende Faktor, ist mit einer globalen Wasserknappheitskrise konfrontiert. Salzwasser ist eine alternative Wasserquelle, während überschüssiges NaCl das Pflanzenwachstum und die Produktivität von Nutzpflanzen verringert. L-Cystein (Cys) ist eine vielversprechende Thiolaminosäure für das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung. Flachs; Linum usitatissimum L. ist eine wirtschaftliche Pflanze mit geringer Salztoleranz. NaCl-Salzstress bei 50 und 100 mM hemmte die Wachstumsparameter, die photosynthetischen Pigmente, den gesamten löslichen Zucker, den gesamten Phenolgehalt und den Aminostickstoff in Flachspflanzen. Salzstress führte zu einem deutlichen Anstieg der Prolin- und Lipidperoxidation und veränderte das Proteinprofil. Die Blattapplikation von Cystein in einer Konzentration von 0,8 und 1,6 mM mildert die schädlichen Auswirkungen von NaCl-Stress auf Flachspflanzen. Cystein verbesserte die Wachstumsmerkmale, photosynthetischen Pigmente, Aminostickstoff, Gesamtphenole und neue Polypeptide in Pflanzen, die unter NaCl-Stress litten. Allerdings verringerte Cystein den Gesamtzucker, Prolin, die Aktivität von Peroxidase und Ascorbatperoxidase. Die Ergebnisse bestätigten, dass Cystein reduzierende Eigenschaften hatte. Darüber hinaus verringerte es den oxidativen Stress durch NaCl und hielt die Stabilität der Membranen aufrecht, indem es die Lipidperoxidation senkte. Insgesamt ist die Redoxkapazität von L-Cystein der Grund dafür, dass es den schädlichen Auswirkungen der NaCl-Toxizität auf das Wachstum von Flachspflanzen entgegenwirken kann.

Wasserknappheit ist weltweit der limitierende abiotische Faktor in der Landwirtschaft. Die zunehmende Wasserknappheit wird bis 2025 zu einem fortschreitenden Rückgang der Pflanzenproduktion führen1,2. Daher ist es notwendig, Wasserquellen zu schützen und nicht-traditionelle Ressourcen wie Salzwasser zu finden. Andererseits kann die Zusammensetzung des Salzwassers unterschiedliche Auswirkungen auf das Pflanzenwachstum und die Ernteproduktivität haben3,4. Normalerweise stimuliert Salzwasser die Synthese reaktiver freier Radikale. Die reaktiven freien Radikale werden giftig, weil sie Proteine, Lipide und Nukleinsäuren angreifen und deren Abbaugeschwindigkeit erhöhen5. Viele Pflanzen induzieren Entgiftungsmechanismen, um die Schäden durch Salzstress zu mildern. Am Entgiftungsmechanismus des schädlichen Radikals sind verschiedene Enzyme beteiligt. Superoxiddismutase ist das erste Abwehrenzym, das Superoxid in H2O26 umwandelt. Katalase und verschiedene Klassen von Peroxidasen fingen das entstehende H2O2 ab. Der Salzgehalt hatte negative Auswirkungen auf die Wasseraufnahme, die Nährstoffverfügbarkeit, den Chlorophyllgehalt, die Photosynthese, die stomatale Leitfähigkeit und die hydraulische Leitfähigkeit der Wurzeln7,8,9.

Flachs (Linum usitatissimum L.) gehört zu den Linaceae und wird als Faser-, Samen- oder Doppelpflanze angebaut10. Leinöl ist mit Omega-3, Linolsäure und Ölsäure angereichert11.

L-Cystein (Cys) ist eine α-Aminosäure mit einer Thiolgruppe, die bei enzymatischen Reaktionen aktiv ist. Cystein ist die wichtigste organische Aminoverbindung, die Schwefelbindungen in Pflanzen reduziert12,13. Das Produkt des L-Cystein-Stoffwechsels ist Glutathion, das zu antioxidativen Mechanismen beigetragen hat. Darüber hinaus können Cysteinderivate in Arabidopsis Mineralionen anreichern14. Die Anwendung von Cystein hat eine überzeugende Wirkung bei der Milderung des abiotischen Stresses auf verschiedene Pflanzenkulturen15. Um dies zu erreichen, zielt die aktuelle Arbeit darauf ab, den Einfluss von L-Cystein auf die Erhöhung der Salztoleranz von Flachspflanzen zu untersuchen.

Die in (Tabelle 1) dargestellten Ergebnisse zeigten unterschiedliche Reaktionen in Flachspflanzen auf die unterschiedlichen Konzentrationen des NaCl-Salzgehalts. Der NaCl-Salzgehalt bei 50 mM reduzierte die Sprosslänge und das Frisch- und Trockengewicht von Spross und Wurzel pro Pflanze signifikant (P < 0,05), während er keine Auswirkungen auf die Wurzellänge hatte. Die Verringerung nahm mit zunehmender Salzkonzentration zu. Die Ergebnisse zeigten, dass NaCl bei 100 mM die Sprosslänge, die Wurzellänge sowie das Frisch- und Trockengewicht von Spross und Wurzel pro Pflanze um 51,20, 46,84, 56,13, 54,10, 81,67 bzw. 62,50 % im Vergleich zu den Kontrollwerten reduzierte. Andererseits erhöhte die Blattapplikation von Cystein (0,8 und 1,6 mM) die vegetativen Wachstumskriterien von Flachspflanzen unter normalen Bedingungen und bei Bewässerung mit Salzlösung erheblich.

Unter normalen Bedingungen verbesserte 1,6 mM Cystein die Sprosslänge sowie das Frisch- und Trockengewicht von Spross und Wurzel um 18,07, 144,24, 52,46, 196,67 und 37,50 % im Vergleich zu den Kontrollpflanzen (Tabelle 1). Die Wechselwirkung zwischen Salzgehalt bei 50 mM und Cystein bei 1,6 mM verursachte signifikante (P < 0,05) Anstiege; 67,74, 258,38, 20,0, 368,75 und 100 % für Sprosslänge, Frisch- und Trockengewicht von Spross und Wurzel pro Pflanze im Vergleich zu den unbehandelten versalzenen Pflanzen (Tabelle 1). Darüber hinaus verbesserte Cystein bei 1,6 mM die Sprosslänge, die Wurzellänge, das Spross- und Wurzeltrockengewicht sowie das Spross- und Wurzelfrischgewicht um 72,85, 80,1, 158,5, 64,3, 563,6 bzw. 133,3 % bei den mit 100 mM NaCl gestressten Pflanzen.

Die photosynthetischen Pigmente in der salzgestressten Pflanze sind im Vergleich zu den Kontrollpflanzen signifikant (P < 0,05) verringert (Abb. 1a – c). Der maximale Rückgang erreichte 38,53 %, 46,67 % bzw. 56 % für Chlorophyll (Chl) a, b und Carotinoide in Pflanzen mit hohem Salzstress.

Wirkung von L-Cystein auf photosynthetische Pigmente; Chlorophyll a (a), Chlorophyll b (b) und Carotinoide (b) in salzgestressten Flachspflanzen. Unterschiede sind statistisch signifikant bei p < 0,05; Vertikale Balken zeigen ± SD an.

Unter Salzstress erhöhte Cystein in hohen Konzentrationen die Chl a-, b- und Carotinoide. Der prozentuale Anstieg von Chlorophyll a, b und Carotinoiden wurde durch 1,6 mM Cystein erreicht und erreichte 51,32, 87,50 bzw. 75,00 % bei Pflanzen mit geringem Stress und 76,12, 68 bzw. 109,09 % bei Pflanzen mit hohem Stress im Vergleich zu den entsprechenden Pflanzen Kontrollanlagen.

Der Salzstress verringerte den gesamten löslichen Zucker in Flachspflanzen im Vergleich zu den Kontrollpflanzen signifikant (P < 0,05) (Abb. 2a). In ähnlicher Weise verringerten Cysteinbehandlungen den gesamten löslichen Zucker in versalzten und nicht versalzten Pflanzen im Vergleich zu ihren Kontrollen deutlich.

Wirkung von L-Cystein auf lösliche Zucker (a), lösliche Phenole (b), Prolin (c) und Amino-N (d) in salzgestressten Flachspflanzen. Unterschiede sind statistisch signifikant bei p < 0,05; Vertikale Balken zeigen ± SD an.

Der Phenolgehalt nahm bei getrennter Anwendung im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollwerten durch Salzgehalt oder Cystein signifikant ab (P < 0,05) (Abb. 2b). Während das Besprühen der Blätter mit Cystein in einer Konzentration von 0,8 mM den Phenolgehalt in salzgestressten Flachspflanzen signifikant verbesserte (P < 0,05). Darüber hinaus zeigte Cystein bei 1,6 mM keine Veränderung unter Stress mit niedrigem Salzgehalt, während die Gesamtphenole unter Stress mit hohem Salzgehalt im Vergleich zu den Werten von Pflanzen ohne Stress anstiegen.

Der Prolingehalt war mit steigender NaCl-Konzentration deutlich erhöht (Abb. 2c). Behandlungen mit Cystein hatten jedoch den gegenteiligen Effekt und führten zu einem verringerten Prolingehalt sowohl in den salzgestressten als auch in den nicht gestressten Pflanzen.

Der Salzgehaltsstress verringerte Amino-N in Flachspflanzen im Vergleich zu den Kontrollpflanzen signifikant (P < 0,05) (Abb. 2d). Der Amino-N-Gehalt zeigte jedoch keine Veränderung in mit Cystein behandelten, nicht gestressten Pflanzen. Die Cysteinbehandlungen erhöhten den Amino-N-Gehalt in Flachspflanzen unter hohem Salzstress im Vergleich zum Kontrollwert signifikant (P < 0,05).

Alle Behandlungen verringerten die Aktivität der Enzyme Peroxidase und Ascorbatperoxidase (Abb. 3a, b) in den Blättern von Flachspflanzen. Die Kontrollhose hatte die höchste Peroxidase- und Ascorbatperoxidase-Aktivität.

Einfluss von L-Cystein auf die Aktivität von POD (a) und APX (b) und die Lipidperoxidation (c) in salzgestressten Flachspflanzen. Unterschiede sind statistisch signifikant bei p < 0,05; Vertikale Balken zeigen ± SD an.

Die Lipidperoxidation, dh der Malondialdehyd (MDA)-Gehalt, war in versalzten Pflanzen signifikant erhöht (P < 0,05) (Abb. 3c). Der höchste MDA-Gehalt lag bei einem hohen Salzgehalt. Cysteinbehandlungen, insbesondere bei 1,6 mM, führten bei salzgestressten Pflanzen im Vergleich zu ihren Kontrollpflanzen zu einem signifikanten Rückgang des MDA.

Die Ergebnisse für das Proteinprofil ergaben insgesamt 30 Polypeptidbanden mit unterschiedlichen Molekulargewichten im Bereich von 15 bis 180 kDa, die mit einem Polymorphieverhältnis von 41,9 % nachgewiesen wurden (Tabelle 2 und siehe ergänzende Abbildung S1 online). In allen behandelten Pflanzen wurden polymorphe Polypeptidbanden mit 180, 110, 93, 73 und 27 kDa induziert. Allerdings gibt es bei allen Behandlungen Banden mit Molekulargewichten (66, 50, 46, 40, 37, 35, 32, 29, 23, 20, 18 und 17 kDa), bei denen es sich um monomorphe Banden handelt. In Pflanzen mit geringem Salzstress werden einzigartige Polypeptidbanden mit Molekulargewichten von 100 und 57 kDa induziert. Darüber hinaus wurden neue polymorphe Polypeptide mit 120, 62, 34 und 31 kDa im Vergleich zu den anderen Behandlungen nur bei stark versalzten Pflanzen und in allen mit Cystein behandelten salzgestressten Pflanzen gefunden. Interessanterweise zeigten alle mit Cystein behandelten salzgestressten Pflanzen im Vergleich zu anderen Behandlungen zwei polymorphe Polypeptide mit Molekulargewichten von 157 und 43 kDa. Andererseits traten bei der Wechselwirkung von 50 mM Salzgehalt mit einer niedrigen bzw. hohen Cysteindosis einzigartige Banden von 64 und 137 kDa auf.

Der Salzgehalt beeinträchtigt die Pflanzenproduktion erheblich16. Der Salzgehaltstress führt zu einem Ungleichgewicht zwischen der Produktion freier Radikale und dem antioxidativen Abwehrsystem17. Darüber hinaus verändert Salzstress die biochemischen Bestandteile wie Photosynthese, Proteinsynthese und Ansammlung von Osmoschutzmitteln16,18.

Das exogene L-Cystein milderte die Auswirkungen des Salzgehalts auf das Wachstum von Flachspflanzen (Tabelle 1). Diese Ergebnisse könnten auf die Umwandlung von L-Cystein in Glutathion (GSH) zurückzuführen sein, das für die Reaktion der Pflanzen auf Salzstress wichtig ist6,15. Darüber hinaus ist L-Cystein an der Proteinassimilation beteiligt; S-Nitrosylierung während der posttranslationalen Modifikation von Proteinen und anschließender Pflanzenstoffwechsel. Darüber hinaus spielt es eine regulierende Rolle bei der Energieerzeugung und der Sulfatreduktion zu organischem Schwefel19,20, was zu einer Verbesserung der Wachstumsparameter und der Toleranz gegenüber Salzstress führt.

Die Chlorophyllpigmente gingen in Flachspflanzen, die Salzstress ausgesetzt waren, deutlich zurück (Abb. 1). Dieser Rückgang könnte auf die Schädigung des Chlorophylls durch das Enzym Chlorophyllase, die Zerstörung der Chloroplastenstruktur oder die Instabilität der Pigment-Protein-Komplexe zurückzuführen sein5. Die Zunahme des photosynthetischen Pigments nach der Blattapplikation von Cystein steht im Einklang mit21. Sie fanden heraus, dass chloroplastisches Cystein als Signalmoleküle fungiert, die die Photosysteme regulieren und schützen. Diese Ergebnisse könnten auf einen der beiden wahrscheinlichen Mechanismen zurückzuführen sein, den ersten; ist der Einfluss von L-Cystein auf die antioxidative Fähigkeit, die schädlichen Auswirkungen freier Radikale, die durch Salzstress entstehen, zu mildern17. Der zweite Mechanismus ist die Bildung von Pyruvat aus L-Cystein22. Pyruvat wandelt sich anschließend in Acetyl um. CoA gilt als Vorstufe vieler biologischer Moleküle wie Chlorophyll, Carotinoide, Phytohormone, Fettsäuren und Proteine. Unsere Ergebnisse stimmen überein und unterstützen den zweiten Mechanismus der L-Cystein-Wirkung bei der Linderung der negativen Auswirkungen von Salzstress auf Pflanzen.

Der Salzgehaltsstress veränderte den Gehalt an löslichen Gesamtzuckern (TSS) (Abb. 2a). Dieses Ergebnis kann auf die Modulation des Osmolytspiegels wie löslicher Zucker zurückzuführen sein. Die in der vorliegenden Studie erzielten Ergebnisse stimmen mit der Studie überein, die auch darauf hindeutet, dass die Modulation und der Transport von Zuckern unter Stressbedingungen mit einer Steigerung der Lignifizierung und der Zellwandbiosynthese sowie ihrer Funktion als Osmolyte und antioxidative Verbindungen verbunden sind23. Darüber hinaus verursachte L-Cystein in allen behandelten Pflanzen niedrigere TSS-Gehalte als die Kontrollwerte. Dieses Ergebnis könnte auf die Wirkung von Cystein bei der Reduktion von Schwefeldonormolekülen zurückzuführen sein, die an der Biosynthese essentieller organischer Verbindungen beteiligt sind12. Zucker sind Vorläufer einer vielfältigen Gruppe phenolischer Verbindungen und einer der vielversprechendsten Kandidaten für den Schutz von Pflanzen vor den negativen Auswirkungen von Umweltstress23,24. Salzstress reduzierte die Gesamtphenole im Vergleich zu Kontrollpflanzen (Abb. 2b). Die Verringerung des Phenolspiegels unter Salzstress kann auf die Oxidation durch die antioxidativen Enzyme zurückzuführen sein, die Phenole als Substrat entziehen. Unterdessen könnte der Anstieg des Gesamtphenolgehalts salzgestresster Pflanzen als Reaktion auf L-Cystein auf die Verschiebung des gesamten löslichen Zuckers nach Cysteinbehandlungen zurückzuführen sein. In ähnlicher Weise erhöhte Cys den Gesamtphenolgehalt in Haferpflanzen (Var. F-411)25 signifikant. Phenole als Substrate für verschiedene antioxidative Enzyme erhöhen die Salztoleranz der Pflanzen, schützen die Zellen vor potenziellen oxidativen Schäden und erhöhen die Stabilität der Zellmembran26.

Prolin fungiert als stickstoffspeichernder, hydrophober Schutzstoff für Enzyme und Zellstrukturen, stabilisiert die Membran und entgiftet freie Radikale19. Der hohe Prolinspiegel in salzgestressten Pflanzen (Abb. 2c) kann auf die Induktion der Proteolyse oder die Erhaltung der Prolinvorläufer zurückzuführen sein19. Diese Ergebnisse stimmen mit27 überein. Sie fanden heraus, dass eine Überproduktion von Prolin mit zunehmendem Salzgehaltsstress einhergeht. Ein höherer Prolingehalt in Pflanzen unter Salzgehaltstress kann auf seine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des Zellturgors oder des osmotischen Gleichgewichts zurückzuführen sein; stabilisierende Membranen verhindern dadurch das Austreten von Elektrolyt und halten reaktive Sauerstoffspezies im normalen Bereich28. Andererseits könnte der geringere Prolingehalt nach der Anwendung von Cystein auf dessen entscheidende Rolle bei der Entgiftung freier Radikale durch Salzstress20 zurückzuführen sein, wodurch oxidativer Stress in Flachspflanzen verhindert wird.

Aminosäuren als schützende Verbindungen können an verschiedenen biologischen Prozessen wie der Redoxhomöostase gegen die Symptome von Salzstress29 beteiligt sein. Die Daten zeigten einen geringeren Amino-N-Gehalt in salzgestressten Pflanzen (Abb. 2d). Dieses Ergebnis könnte auf die Herunterregulierung der Proteinsynthese von salzgestressten Flachspflanzen zurückzuführen sein. Die höheren Amino-N-Werte in salzgestressten Pflanzen, die mit L-Cystein-Behandlungen behandelt wurden, können mit den Veränderungen im Proteinstoffwechsel und der Hochregulierung des K+-Transports zusammenhängen, um durch Stress geschädigte Pflanzen zu lindern29,30,31. Ebenso wurde berichtet, dass die exogene Anwendung von L-Arginin und L-Ornithin ein starkes Potenzial hat, den Auswirkungen von abiotischem Stress auf Weizen-32- und Zuckerrübenpflanzen6 zu begegnen, indem sie die Synthese von Aminosäuren, Proteinen und Antioxidantiensystemen fördert.

Alle Behandlungen verringerten die APX- und POX-Aktivitäten im Vergleich zu den Kontrollwerten signifikant (P < 0,05). Der Salzgehalt kann zu einem Ungleichgewicht zwischen den antioxidativen Enzymen und dem reaktiven freien Radikal führen. L-Cystein senkte die Aktivität der antioxidativen Enzyme. Die Ergebnisse stimmen mit33 überein. Die Autoren berichteten über einen Rückgang der Aktivität von CAT, APX und PPO in Basilikumpflanzen, die im vegetativen Stadium mit Cystein behandelt wurden. Um die erhaltenen Ergebnisse zu erklären, schlugen wir vor, dass die mildernde Wirkung von Cys auf Salzstress eher mit seiner direkten ROS-Fängereigenschaft als mit seiner Wirkung auf das Antioxidationssystem zusammenhängt. Diese Erklärung wurde dadurch gestützt, dass Cys die Notwendigkeit einer Aktivierung des Antioxidationssystems verringerte, indem es als ROS-Fänger fungierte17.

Schwankungen im Lipidperoxidationsgehalt und in der Aktivität antioxidativer Enzyme erklären den Einfluss von Cystein auf die Senkung des ROS-Spiegels. Der hohe MDA gilt als Biomarker für oxidativen Stress6. Salzstress erhöhte den MDA-Gehalt in Flachspflanzen signifikant (P < 0,05), während die Behandlung mit Cystein diesen Anstieg abschwächte. Diese Ergebnisse bewiesen den Einfluss von Cystein auf die Linderung von oxidativen Schäden, die durch Salzstress verursacht werden. Das gleiche Ergebnis wurde bei der Basilikumpflanze von33 festgestellt. In der vorliegenden Studie nutzen mit Cystein behandelte Flachspflanzen unterschiedliche Mechanismen, um Salzstress zu tolerieren, indem sie nicht-enzymatische Antioxidantien verstärken; Carotinoide und Gesamtphenole. Die positive Wirkung von Cystein könnte auf die Produktion von Glutathion20,34 oder Gesamtphenolverbindungen (Abb. 2) zurückzuführen sein, die über eine antioxidative Kapazität35 verfügen, um überschüssige freie Radikale abzufangen.

Was das Proteinprofil betrifft, kann die Induktion einzigartiger Polypeptide von 100 und 57 kDa bei niedrigem Salzgehalt auf das Vorhandensein von zwei reagierenden Genen zurückzuführen sein, die mit der Salzstresstoleranz zusammenhängen. Andererseits traten bei niedrigem Salzgehalt einzigartige Polypeptide mit 64 und 137 kDa nur in gestressten Pflanzen auf, die mit niedrigen bzw. hohen Konzentrationen an L-Cystein behandelt wurden. Diese Ergebnisse bedeuten, dass L-Cystein abhängig von seiner Konzentration die Expression von zwei verschiedenen Genen stark beeinflussen kann. Darüber hinaus sagte das Auftreten von fünf neuen Proteinen nach L-Cystein- oder Salzbehandlungen deren Stressorwirkung auf diese fünf Gene gleichermaßen voraus. Darüber hinaus deutete die Induktion neuer polymorpher Banden in salzgestressten Pflanzen als Reaktion auf Cysteinbehandlungen darauf hin, dass L-Cystein möglicherweise eine Rolle bei lebenswichtigen Prozessen wie der Redoxregulation oder der Signaltransduktion durch Modulation von Polypeptiden spielt, die für die oxidative Spannung verantwortlich sind19,36.

NaCl-Salzstress wirkte sich negativ auf die Wachstumsparameter und die biochemischen Bestandteile von Flachspflanzen aus. Es beeinflusst Osmolyte, den Antioxidationsstatus und die Membranstabilität. Allerdings steigerte L-Cystein die Biosynthese von photosynthetischen Pigmenten, Gesamtphenolen, Amino-N und neuen Polypeptiden. Es sorgte für die Stabilität der Membranen, indem es die Lipidperoxidation senkte, und regulierte das osmotische Gleichgewicht, indem es den Gesamtgehalt an löslichen Zuckern und Prolin anpasste. Es veränderte auch den antioxidativen Status, indem es die antioxidativen Enzyme als Abwehrmechanismus nutzte, um oxidativen Salzstress zu mildern. Letztendlich können die vielfältigen positiven Rollen von exogenem Cystein die negativen Auswirkungen von NaCl-Stress auf das Wachstum und die Entwicklung von Leinsamen effektiv überwinden.

Während der Wintersaison 2017/2018 wurde an der Fakultät für Naturwissenschaften (Mädchenzweig) der Al-Azhar-Universität, Nasr City, Kairo, Ägypten, ein Gewächshausexperiment durchgeführt, um die Auswirkung des Salzgehalts (0, 50, 100 mM) zu untersuchen. und Cystein (0, 0,80, 1,6 mM) auf Wachstum und biochemische Bestandteile von Flachspflanzen. Leinsamen (Sorte; Giza 9) wurden vom Agriculture Research Center (ARC), Gizeh, Ägypten, bezogen. Die Aussaat der Samen erfolgte am 14. November in mit Sandboden gefüllten Tontöpfen Nr. 50. Das Experiment hatte einen völlig zufälligen Aufbau mit sechs Wiederholungen für jede Behandlung. Vor der Aussaat wurden Calciumsuperphosphat und Kaliumsulfat zugesetzt. Ammoniumnitrat wurde in zwei Abständen nach der Aussaat ausgebracht30,37.

45 Tage nach der Aussaat wurden von jeder Behandlung drei repräsentative Proben zur Bestimmung der Wachstumsmerkmale entnommen. Die chemischen Bestandteile im Blatt wurden im vegetativen Stadium geschätzt.

Chlorophyll a, Chlorophyll b und Gesamtcarotinoide wurden aus 0,1 g frischen Blättern in 10 ml 85 %igem Aceton extrahiert und gemäß38 gemessen. Die homogenisierten Proben wurden bei 3000 U/min zentrifugiert und der Überstand mit Aceton (85 %) auf 10 ml aufgefüllt. Die Absorption wurde bei 663, 644 und 452 nm mit einem Spektrophotometer (VEB Carl Zeiss) unter Verwendung von Aceton als Blindwert aufgezeichnet. Die Konzentration der Pigmentfraktionen (Chlorophyll a, Chlorophyll b und Carotinoide) wurde mithilfe der folgenden Gleichungen in µg/ml berechnet:

Die Konzentrationen von Chlorophyllen und Carotinoiden wurden in mg g-1 Frischgewicht (FW) des Pflanzenmaterials ausgedrückt.

Der gesamte lösliche Zucker (TSS) wurde in frischen Blättern basierend auf der Anthrone-Technik gemäß39 bestimmt. Der TSS-Gehalt wurde analysiert, indem 0,1 ml Ethanolextrakt mit 3 ml frisch zubereitetem Anthron (150 mg Anthron + 100 ml 72 % H2SO4) in einem kochenden Wasserbad 10 Minuten lang umgesetzt und die gekühlten Proben bei 625 nm mit einem Spektrophotometer abgelesen wurden ( VEB Carl Zeiss). Der gesamte lösliche Zucker wird anhand einer Standard-Glukosekurve berechnet.

Die gesamten löslichen Phenole wurden in frischen Blättern mit der Folin-Ciocalteau-Reagenzmethode gemäß40 bestimmt. Ein ml des Extrakts wurde zehn Minuten lang in einem kochenden Wasserbad zu zehn Tropfen konzentrierter HCl gegeben und abgekühlt. Anschließend wurden ein ml Folin-Ciocalteau-Reagenz und 1,5 ml 14 %iges Natriumcarbonat gemischt. Die Mischung wurde mit bis zu 5 ml destilliertem Wasser versetzt, gut geschüttelt und dann 5 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad gehalten. Die Absorption bei 650 nm wurde notiert und die Daten unter Verwendung einer Pyrogallol-Standardkurve in mg g−1 FW dargestellt.

Ein bekanntes Gewicht (0,5 g) frischer Blätter wurde in 10 ml 3 %iger wässriger Sulfosalicylsäure extrahiert. Zwei ml des Überstands wurden mit 2 ml saurem Ninhydrinreagenz bzw. 2 ml Eisessig gemischt. Nachdem die Mischung eine Stunde lang bei 100 °C gekocht worden war, wurde sie in einem Eisbad abgekühlt und Toluol (4 ml) zur Reaktionsmischung gegeben. Die Absorption wurde bei 520 nm unter Verwendung von Toluol als Blindprobe mit einem Spektrophotometer aufgezeichnet41.

Amino-N in frischen Blättern von Flachspflanzen wurde mit der Ninhydrin-Methode gemäß42 nachgewiesen.

Der rohe Enzymextrakt wurde gemäß43 hergestellt, um verschiedene Enzyme im Zusammenhang mit der antioxidativen Aktivität in frischen Blattproben zu testen.

Die POD-Aktivität wurde in der Reaktionsmischung getestet, einschließlich 0,2 ml Enzymextrakt in einer Pufferlösung, die 5,8 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), 2,0 ml 20 mM Pyrogallol und 2,0 ml 20 mM H2O2 enthielt. Der Absorptionsanstieg wurde bei 470 nm über 60 s bestimmt. Eine Einheit Enzymaktivität ist definiert als die Enzymmenge, die die Umwandlung von einem Mikromol H2O2 pro Minute bei 25 °C44 katalysiert.

Die APX-Aktivität wurde gemäß45 untersucht. Die Reaktionsmischung enthält Kaliumphosphatpuffer (50 mM; pH 7,0), Ascorbinsäure (0,5 mM), H2O2 (1,0 mM) und 50 μl Enzymextrakt in einem Endvolumen von 1 ml. Die Aktivität von APX wurde 3 Minuten lang bei 290 nm nachgewiesen.

Ein Frischgewicht (0,2 g) wurde mit 10 ml Trichloressigsäure (1 % w/v) extrahiert. Der Extrakt wurde 10 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert. Die Lipidperoxidation wurde anhand der Thiobarbitursäure-Reaktion gemäß dem Assay von46 gemessen. Der Überstand (2,0 ml) wurde zu 4,0 ml 0,5 % Thiobarbitursäure (TBA) in 20 % TCA gegeben. Die Lösung wurde 30 Minuten lang auf 95 °C erhitzt und dann sofort abgekühlt und 10 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert. Die Absorption wurde bei 532 und 600 nm mit einem Spektrophotometer aufgezeichnet. Durch Subtraktion des Absorptionswerts bei 600 nm wurde der MDA-Gehalt anhand seines Absorptionskoeffizienten von 155 nmol cm−1 ermittelt und als nmol g−1 Frischgewicht ausgedrückt.

Der Proteinextrakt wurde durch schnelles Einfrieren von 0,2 g frischen Blättern unter Verwendung von flüssigem Stickstoff hergestellt und anschließend wurde das Proteinprofil mithilfe von SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt47. Die Molekulargewichte der getrennten Proteine wurden anhand von Standard-Molekulargewichtsmarkern (Marker, 15–180 kDa; Sigma, St. Louis, USA) geschätzt.

Experimentelle Verfahren und Feldstudien an Pflanzen entsprechen den relevanten institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetzen.

Die Daten wurden mithilfe einer Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) gemäß48 analysiert. Die geringsten signifikanten Unterschiede (LSD) mit einer Wahrscheinlichkeit von 5 % wurden berechnet, um die Mittelwerte verschiedener Behandlungen zu vergleichen.

Die Datenverfügbarkeit und Materialdaten sind in einer Zusatzdatei ersichtlich.

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Die Autoren danken der Abteilung für Botanik und Mikrobiologie, Fakultät für Naturwissenschaften (Mädchenabteilung), Al-Azhar-Universität, Kairo, Ägypten, und dem University College of Nairiyah, University of Hafr Al Batin (UHB), Saudi-Arabien. Die Autoren danken der Biologieabteilung des College of Science der Universität Hafr Al Batin (UHB), Saudi-Arabien.

Diese Forschung erhielt keine Mittel von öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Stellen.

Abteilung für Botanik und Mikrobiologie, Fakultät für Naturwissenschaften (Zweig für Mädchen), Al-Azhar-Universität, Kairo, 11754, Ägypten

Hebat-Allah A. Hussein

Abteilung für Biologie, College of Science, Universität Hafr Al-Batin (UHB), Hafr Al Batin, 31991, Saudi-Arabien

Shifaa O. Alshammari

Abteilung für Biologie, University College of Nairiyah, University of Hafr Al-Batin (UHB), Nairiyah, 31991, Saudi-Arabien

Hebat-Allah A. Hussein

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HAH führte das Experiment durch und SOA analysierte die Ergebnisse und verfasste das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Hebat-Allah A. Hussein.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 13. Januar 2022

Angenommen: 10. Juni 2022

Veröffentlicht: 05. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14689-7

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