Auswirkungen von Pflanzenwachstumsregulatoren und Saccharose auf die Proliferation und Qualität von embryogenem Gewebe in Picea pungens

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 13194 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Embryogenes Gewebe (ET) ist wichtig für die genetische Veränderung und Pflanzenregeneration. Die Proliferationsfähigkeit und Kraft von ET sind entscheidend für die Pflanzenvermehrung über die somatische Embryogenese. In dieser Studie wurde ET aus reifen zygotischen Embryonen in Blaufichte (Picea pungens Engelm.) induziert. Es gab signifikante Unterschiede in der ET-Induktion zwischen zwei Provenienzen, nämlich 78,8 ± 12,5 % bzw. 62,50 ± 12,8 %. Die Auswirkungen von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), 6-Benzylaminopurin (6-BA) und/oder Saccharose auf die ET-Proliferation und die Reifung des somatischen Embryos (SE) wurden mit vier Zelllinien weiter untersucht. Die höchste ET-Proliferationsrate erreichte 1473,7 ± 556,0 % alle zwei Wochen. Konzentrationen von 2,4-D oder 6-BA, die im Stadium der Gewebeproliferation angewendet wurden, beeinflussten die SE-Reifung unter den Zelllinien, während Saccharose weniger Auswirkungen zeigte. Die höchste Rate, 408 ± 230 reife SEs/g FW, wurde in SE-Reifungskulturen erreicht. Diese Forschung zeigte, dass die Kulturbedingungen, dh die spezifischen Konzentrationen von 2,4-D und BA, im ET-Proliferationsstadium nicht nur das ET-Wachstum, sondern auch die Qualität von ET für die SE-Reifung beeinflussten. Diese Studie zeigte die Notwendigkeit und den Nutzen der Entwicklung sowohl allgemeiner als auch genotypspezifischer Protokolle für die effiziente Produktion reifer SEs oder somatischer Pflanzen in Blaufichten auf.

Die Nadeln der Blaufichte (Picea pungens Engelm.) haben das ganze Jahr über eine silberblaue Farbe, die für die Landschaftsgestaltung von hohem Zierwert ist1. Derzeit wird Blaufichte in China im Allgemeinen durch Samenkeimung regeneriert2,3. Aufgrund der hohen Preise für Saatgut und Setzlinge ist die Zahl der eingeführten Elitesorten begrenzt4. Die Nadeln der Nachkommen können in Farbe, Form, Struktur und Wachstumsgeschwindigkeit unterschiedlich sein und die Qualität der Sämlinge ist daher begrenzt. Die Technologie der somatischen Embryogenese kann genutzt werden, um in relativ kurzer Zeit eine große Anzahl somatischer Pflanzen mit konsistenten genetischen Merkmalen zu produzieren5, was sich daher positiv auf die groß angelegte Vermehrung von Elite-Genotypen in der Blaufichte auswirkt.

Derzeit könnten viele Baumarten durch somatische Embryogenese vermehrt werden. Der erste Erfolg der somatischen Embryogenese bei Nadelbäumen lässt sich auf das Jahr 1985 zurückführen, als Hakman et al.6 unreife zygotische Embryonen der Gemeinen Fichte (Picea abies) verwendeten, um embryogenes Gewebe (ET) zu induzieren, und dann reife somatische Embryonen (SEs) erhielten. Seit 2000 wurden mehrere Artikel zur Optimierung der somatischen Embryogenese bei Nadelholzarten veröffentlicht, darunter: Pinus radiata7, Picea abies8, Picea glauca9, Larix-Hybriden10, Koreanische Kiefer11,12,13,14, Abies nebrodensis15, Abies nordmanniana16, Abies alba17 und Blaufichte1 . Die Proliferation von ET zusammen mit der SE-Reifung sind Schlüsselschritte für die Vermehrung in großem Maßstab und die langfristige Erhaltung des Keimplasmas von Nadelbäumen15. Nielsen et al.16 berichteten über starke klonale Effekte bei den meisten Merkmalen während des Ausbreitungsprozesses über SEs in Abies nordmanniana16. Die schwerwiegende Zelllinienabhängigkeit zwischen ET-Proliferation und SE-Reifung wurde auch bei Abies alba17 berichtet. Untersuchungen dieser Art wurden bisher bei der Blaufichte nicht durchgeführt.

Es liegen nur wenige Forschungsberichte über die Einleitung der somatischen Embryogenese bei Blaufichten vor. Afele et al.18 verwendeten reife Blaufichtenembryonen als Explantate für die ET-Induktion. Die höchste ET-Induktionsrate betrug 16 %, und die Anzahl der produzierten somatischen Embryonen (SEs) betrug nur 9,7 SEs/g FW. Sun et al.4 optimierten das ET-Induktionssystem weiter. Sie erreichten eine Induktionsrate von bis zu 45,5 %. In den folgenden Stadien gab es jedoch viele abnormale Embryonen, was zu einer schlechten SE-Keimungsfähigkeit führte. Hazubska-Przyby et al.19 induzierten ET aus zygotischen Embryonen mit der höchsten Induktionsrate von 23,75 %, wohingegen keine reifen SEs erhalten wurden. Tao et al.1 entwickelten erstmals ein vollständiges technisches System der somatischen Embryogenese in der Blaufichte, einschließlich der Kulturen der ET-Induktion und -Proliferation, der SE-Reifung, der SE-Keimung und -Umwandlung sowie der Härte somatischer Pflanzen. Das technische System der somatischen Embryogenese bei Blaufichten muss jedoch weiter optimiert werden, um die Probleme zu lösen, wie z. B. die geringen Raten der ET-Induktion und -Proliferation sowie die schlechte SE-Reifungsfähigkeit. All diese Faktoren begrenzten den großflächigen Vermehrungsprozess über die somatische Embryogenese bei Blaufichten. Das Wesen der ET-Proliferation ist die Zellteilung der proembryogenen Masse. Faktoren wie 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), 6-Benzylaminopurin (6-BA) und Saccharose zeigten großen Einfluss auf die ET-Proliferation20, ebenso wie die Kulturbedingungen im ET-Proliferationsstadium. Es gab jedoch nur wenige Studien zu ihren Auswirkungen auf die SE-Reifung danach. Es gibt verschiedene Faktoren, die die SE-Reifung beeinflussen21,22. Es ist wichtig, die Auswirkung der Kulturbedingungen im ET-Proliferationsstadium auf die SE-Reifung zu untersuchen, um das gesamte Kultursystem für die Massenvermehrung zu optimieren. In dieser Studie wurden reife zygotische Embryonen von Blaufichten aus zwei Provenienzen als Explantate zur Induktion von ET verwendet, und die induzierten ETs wurden als experimentelle Materialien verwendet, um die Auswirkungen von 2,4-D, 6-BA und/oder Saccharose auf ET zu untersuchen Proliferationsraten und die ET-Qualität bei der SE-Reifung, um das SE-System für eine effiziente Produktion somatischer Elitepflanzen in der Blaufichte zu optimieren.

Reife Blaufichtensamen aus zwei Herkünften wurden mit F1 und F2 gekennzeichnet und vor der Verwendung in einem Gefrierschrank bei -40 °C gelagert. Die Samen wurden 2010 von Carson Forest (Herkunft F1), NM, USA, oder 2008 von San Isabel (Herkunft F2), CO, USA, gekauft. Die Samen hatten unterschiedliche Genotypen, die von verschiedenen Mutterbäumen durch offene Bestäubung produziert wurden . Die Samen für den Test wurden 18 Stunden lang mit fließendem Leitungswasser gespült und dann auf eine ultrareine Werkbank gelegt und 30 Sekunden lang mit 75 % Alkohol sterilisiert. Anschließend wurden die Samen 3–5 Mal mit sterilem destilliertem Wasser gespült und 15 Minuten mit NaClO-Lösung (4 % Chlor) sterilisiert, bevor sie 3–5 Mal mit sterilem Wasser gespült wurden. Die Samenschale und die Megagametophyten wurden mit einem Skalpell entfernt. Die Embryonen wurden entnommen und als Explantate verwendet. Die präparierten Embryonen wurden horizontal auf die Oberfläche des Kulturmediums gelegt. Das ET-Induktionsmedium war das modifizierte LV (mLV)-Medium23,24, ergänzt mit 4,0 mg/L 2,4-D, 1,0 mg/L 6-BA, 10 g/L Saccharose, 0,8 g/L säurehydrolysiertes Casein (Kasein). Hydrolysat, CH), 0,5 g/L L-Glutamin und 4 g/L Gedrite.

Zwei Monate nach der Kultivierung mit dem Proliferationsmedium wurde der induzierte ET für die Experimente zur ET-Proliferation und SE-Reifung verwendet. Alle zwei Wochen wurde ein neues Medium ausgetauscht und es wurden vier ausgewählte Zelllinien verwendet, darunter die Zelllinien 2#04, 2#13, 1#16 und 2#02. Unter diesen wurde die Zelllinie 1#16 von der F1-Quelle induziert, während die Zelllinien 2#04, 2#13 und 2#02 von der F2-Quelle induziert wurden. Der ET der transparenten filamentösen Morphologie wurde für Subkulturen ausgewählt, um für nachfolgende Tests möglichst viel ET zu erhalten. Für die ET-Proliferation wurde das mLV-Medium verwendet, das mit 1,0 mg/L 6-BA und 2,0 mg/L 2,4-D ergänzt wurde. Die übrigen Kulturbedingungen entsprachen den im Abschnitt „ET-Induktion“ beschriebenen.

Für das Experiment des 2,4-D-Tests wurde Kulturmedium von mLV als Basismedium verwendet. Es wurde mit 0, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 oder 6,0 mg/L 2,4-D, 1,0 mg/L 6-BA ergänzt. Die anderen Kulturbedingungen waren die gleichen wie in 2.1 beschrieben. Für die Datenerfassung für jede Behandlung und jede Zelllinie wurden mindestens fünf Petrischalen verwendet. Das Experiment wurde bei Bedarf wiederholt. Der anfängliche ET für die Inokulation betrug 0,2 g pro Petrischale. Nach 14 Tagen wurde das Frischgewicht (g) der ETs in jeder Schale gewogen, um die ET-Proliferationsrate anhand der folgenden Formel zu berechnen.

Für dieses Experiment wurden die gleichen vier Zelllinien verwendet. Dem basalen mLV-Medium wurden 0, 0,5, 1,0, 2,0 oder 3,0 mg/L 6-BA bzw. 2,0 mg/L 2,4-D zugesetzt. Die übrigen Kulturbedingungen entsprachen den im Abschnitt „ET-Induktion“ beschriebenen. Für jede Behandlung mit jeder Zelllinie wurden fünf Petrischalen verwendet.

Für das Experiment wurden die gleichen Zelllinien verwendet. Dem Basismedium wurden 5, 10, 20 oder 30 g/L Saccharose jeweils mit 2,0 mg/L 2,4-D und 2,0 mg/L 6-BA zugesetzt. Die übrigen Kulturbedingungen entsprachen denen im Abschnitt „ET-Induktion“. Für jede Behandlung mit jeder Zelllinie wurden fünf Petrischalen verwendet.

In Proliferationskulturen wurde ET derselben vier Zelllinien auf der Grundlage der in den Abschnitten „Experimente mit unterschiedlichen Konzentrationen von Pflanzenwachstumsregulatoren“ und „Experiment mit unterschiedlichen Saccharosekonzentrationen“ beschriebenen Methoden behandelt. Der ET nach den Behandlungen für 7–10 Tage in Proliferationskulturen wurde für die SE-Reifung verwendet, um die ET-Qualität zu bestimmen. Ungefähr 80 mg ET wurden zu 4 ml flüssigem Medium gegeben, bei dem es sich um das Proliferationsmedium ohne Pflanzenwachstumsregulatoren und das Verfestigungsmittel handelte. Das Gewebe wurde gut mit dem Kulturmedium vermischt. Nachdem die Mischung filtriert wurde, wurde das Filterpapier mit ET darauf auf SE-Reifungsmedium in einer Petrischale mit 10 cm Durchmesser gelegt. Zur SE-Differenzierung und -Reifung wurde das Basalmedium (mLV) mit 13,22 mg/L Abscisinsäure (ABA), 30 g/L Saccharose, 6 g/L Gelrite, 0,8 g/L CH und 0,5 g/L L-Glutamin ergänzt und 2 g/L Aktivkohle (AC). Für jede Behandlung mit jeder Zelllinie wurden fünf Petrischalen verwendet. Die Kultur wurde im Dunkeln bei 23 ± 2 °C gehalten und die Anzahl der SEs wurde nach einer 60-tägigen SE-Reifungskultur gezählt. Somatische Embryonen mit gut entwickelten Keimblättern wurden als reife SEs gezählt.

Pflanzengewebe wurden in verschiedenen Kulturstadien gesammelt, einschließlich des Gewebes aus der ET-Proliferationskultur für 7–10 Tage (frühe unreife SEs); Gewebe in SE-Reifungskultur für 5 Tage (Stadium I), 10 Tage (Stadium II), 30 Tage (Stadium III), 45 Tage (Stadium IV) und 60 Tage (Stadium V). Die Pflanzenmaterialien (0,1 g ET) in jedem Stadium wurden 10 Minuten lang mit 0,1 %iger Safraninlösung gefärbt, auf einen Objektträger gelegt, mit einem Tropfen Wasser getropft und mit einem Deckglas abgedeckt. Der ET wurde durch leichtes Klopfen mit dem flachen Ende eines Bleistifts gleichmäßig verteilt und sofort beobachtet und mit einem Mikroskop (OLYMPUS CX 31, Japan; ausgestattet mit einer Canon DS126271-Kamera, Japan) fotografiert.

Die Berechnungen wurden mit Excel 2003 (Microsoft, USA) durchgeführt. Die einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) und Duncans Mehrfachvergleichstests wurden mit SPSS 19 (IBM, USA) durchgeführt. Die Diagramme wurden mit Sigma Plot 12.0 (Systat, USA) erstellt.

Die Autoren erklären, dass die Pflanzenstudie in dieser Forschung, einschließlich der Sammlung von Pflanzenmaterialien, den einschlägigen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetzen entspricht.

Nachdem sie 7 Tage lang auf ET-Induktionsmedium gelegt worden waren, expandierten zygotische Embryonen als Explantate und die Keimblätter vergrößerten sich (Abb. 1a). Nicht-embryonaler Kallus (NEC) und ET wurden unter den Behandlungen mit 2,4-D in unterschiedlichen Konzentrationen induziert. Die Oberfläche von NEC war hart, gelbgrün und körnig (Abb. 1b), während ET als weiße, flauschige Filamente erschien (Abb. 1c). Die erreichte ET-Induktionsrate betrug 62,50 ± 12,8 % bzw. 78,8 ± 12,5 % mit Provenienz L1 bzw. Provenienz L2.

Der Prozess der ET-Induktion in Blaufichte. (a) ein zygotischer Embryo auf ET-Induktionsmedium für 7 Tage; (b) Nicht embryogener Kallus in der Induktionskultur für 60 Tage; (c) Embryogenes Gewebe in der Induktionskultur für 60 Tage. Alle Stäbe = 3 mm.

Verschiedene Stadien der SE-Entwicklung und -Reifung sind in Abb. 2 dargestellt. Die frühen unreifen SEs existierten und vermehrten sich im ET-Proliferationsstadium (Abb. 2a) nach einer 7- bis 10-tägigen Proliferationskultur, und der ET wurde zur Stimulierung der SE-Reifung verwendet. In einer 5-tägigen Reifungskultur erreichten die SEs das Embryonalentwicklungsstadium I und die SEs waren kugelförmig (Abb. 2b). Die SEs entwickelten sich nach 10 Tagen in der reifen Kultur zum Stadium II und das SE war zylindrisch (Abb. 2c). Nach 30-tägiger Kultivierung begannen die SEs im Stadium III mit der Entwicklung von Keimblättern (Abb. 2d). Die Keimblätter verlängerten sich weiter, nachdem SEs etwa 45 Tage lang auf Reifungsmedium im Stadium IV kultiviert wurden (Abb. 2e). Somatische Embryonen reiften im Entwicklungsstadium V nach 60 Tagen in der Kultur vollständig mit gut entwickelten Keimblättern heran (Abb. 2f).

Somatische Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien der Blaufichte. (a) Frühe unreife SEs in ET-Proliferationskultur für 7 bis 10 Tage, Balken = 50 μm; (b–f) Die SE in Reifungskultur für 5 Tage (b), 10 Tage (c), 30 Tage (d), 45 Tage (e) bzw. 60 Tage (f). Balken (b–f) = 2 mm.

Wenn 2,4-D im Kulturmedium nicht ergänzt wurde, wurden in ET nur wenige frühe unreife SEs beobachtet und die Struktur der SEs war schlecht (Abb. 3a), da die SEs aus kleinen, lockeren Embryonen und weniger organisierten Suspensoren bestanden; Bei 2,4-D-Konzentrationen zwischen 1,0 und 4,0 mg/l wurden mehr SEs geschätzt als bei der Kultur ohne 2,4-D im Medium (Abb. 3b – e); Die Anzahl der frühen SEs im ET begann im Vergleich zu Abb. 3c–e abzunehmen, wenn 6,0 mg/L 2,4-D ergänzt wurden (Abb. 3f). In allen sechs Behandlungen betrug die optimale 2,4-D-Konzentration 3,0 mg/L (Abb. 3d), womit die höchste SE-Zahl und die besten SE-morphologischen Eigenschaften, d. h. der eigentliche dichte Embryo mit einem gut entwickelten Suspensor, erzielt wurden. wurden erhalten.

Auswirkungen von 2,4-D auf die ET-Struktur während der Proliferation in Blaufichte. (a) ET in der Kultur, wenn 2,4-D im Medium fehlte; (b) ET in Proliferationskultur, ergänzt mit 1,0 mg/L 2,4-D; (c) ET in Proliferationskultur, ergänzt mit 2,0 mg/L 2,4-D; (d) ET in Proliferationskultur, ergänzt mit 3,0 mg/L 2,4-D; (e) ET in Proliferationskultur, ergänzt mit 4,0 mg/L 2,4-D; (f) ET in Proliferationskultur, ergänzt mit 6,0 mg/L 2,4-D. Pfeile zeigen auf somatische Embryonen. Alle Balken = 50 µm.

Es bestand ein signifikanter Unterschied zwischen den Kontrollkulturen (2,4-D fehlte im Kulturmedium) und denen, die 2,4-D in bestimmten Konzentrationen enthielten (Abb. 4a – e). Wenn die 2,4-D-Konzentrationen im Bereich von 0,0–2,0 mg/l lagen, stieg die Proliferationsrate mit der Zunahme von 2,4-D in allen Zelllinien (Abb. 4a–d). Wenn die 2,4-D-Konzentrationen zwischen 0,0 und 3,0 mg/L lagen, stieg die Proliferationsrate der Zelllinie 1#16 mit den höheren 2,4-D-Konzentrationen, während die Proliferationsrate abnahm, wenn die 2,4-D-Konzentration 4,0 überstieg mg/L (Abb. 4c). Bei der Zelllinie 2#04 scheinen 4 mg/L 2,4-D eine hohe Anzahl reifer SEs zu ergeben. Es war jedoch nur für die Kontrolle statistisch signifikant, ohne dass der Kultur 2,4-D zugesetzt wurde. Bei allen vier Zelllinien wurde die höchste Proliferationsrate erreicht, wenn dem Kulturmedium 2,0 mg/L 2,4-D zugesetzt wurde (Abb. 4e).

Auswirkungen von im Gewebeproliferationsstadium ergänzten 2,4-D-Konzentrationen auf die ET-Proliferation und SE-Reifung bei verschiedenen Zelllinien in Blaufichte. (a) Proliferation der Zelllinie 2#04; (b) Proliferation der Zelllinie 2#13; (c) Proliferation der Zelllinie 1#16; und (d) Proliferation der Zelllinie 2#02; (e) Proliferation aller Zelllinien; (f) Reifung der Zelllinie 2#04; (g) Reifung der Zelllinie 2#13; (h) Reifung der Zelllinie 1#16; und (i) Reifung der Zelllinie 2#02; (j) Reifung aller Zelllinien. Mittelwert ± SE, N = 5 für einzelne Zeilen oder 20 für alle vier Zeilen, unterschiedliche Kleinbuchstaben zeigen einen signifikanten Unterschied bei p ˂ 0,05 an.

In SE-Reifungskulturen bestand ein signifikanter Unterschied zwischen der Kontrolle und den Behandlungen einiger spezifischer Konzentrationen von 2,4-D (Abb. 4f – g). Wenn die 2,4-D-Konzentrationen zwischen 1,0 und 4,0 mg/l lagen (Abb. 4a), gab es keinen signifikanten Unterschied in der SE-Entwicklung und -Reifung mit der Zelllinie 2#04 (Abb. 4f); Zelllinie 2#13 zeigte eine höhere Proliferationskapazität als die anderen mit 2,4-D-Konzentrationen zwischen 1,0 und 2,0 mg/L (Abb. 4b), und die ET hatte die höchste Proliferationskapazität mit 2,0 mg/L, während 1,0 mg/L L 2,4-D führte zur höchsten Anzahl reifer SEs (408 ± 230 reife SEs/g FW) (Abb. 4g); Zelllinie 1#16 hatte die höchste Proliferationsfähigkeit, wenn die 2,4-D-Konzentration 3,0 mg/L betrug (Abb. 4c), während Wreans bei 1,0 mg/L die SE-Entwicklungs-/Reifungsfähigkeit am besten war (318 ± 84 reife SEs/ g FW) (Abb. 4h); Zelllinie 2#02 zeigte die höchste Proliferationsfähigkeit bei einer 2,4-D-Konzentration von 2,0 mg/l (Proliferationsrate erreichte bis zu 1473,7 ± 556,0 %, Abb. 4d), wohingegen bei 6,0 mg/l die SE-Entwicklung/Reifung erfolgte Die Fähigkeit war am besten (333 ± 37 reife SEs/g FW) (Abb. 4i). Bei allen vier Zelllinien wurde die höchste SE-Reifungsfähigkeit erreicht, wenn dem Kulturmedium 1,0 mg/L 2,4-D zugesetzt wurde (Abb. 4j).

Die Auswirkung der 6-BA-Konzentration auf die ET-Struktur der vier Zelllinien ist in Abb. 6 dargestellt. Wenn dem Medium kein 6-BA zugesetzt wurde, war die Anzahl der frühen SEs in ET geringer als die des mit 1 behandelten Gewebes mg/L 6-BA (Abb. 5a). Der eigentliche Embryo war gut organisiert, aber die SEs waren winzig; Wenn die 6-BA-Konzentrationen zwischen 0,5 und 3 mg/l lagen, war der Unterschied in der Anzahl der frühen SEs bei ET nicht offensichtlich (Abb. 5b – e). Wenn der Kultur 2 mg/l 6-BA zugesetzt wurden, sahen die frühen unreifen Embryonen gesund aus, da die Größe der SE relativ größer war, die Zellen im eigentlichen Embryo dicht gepackt waren und die Suspensoren klar definiert waren.

Auswirkungen von 6-BA-Konzentrationen auf die SE-Differenzierungsfähigkeit bei Blaufichten. (a) ET-Proliferation in der Kultur ohne 6-BA; (b–e) ET in der Proliferationskultur von 0,5 mg/L 6-BA, 1,0 mg/L 6-BA (c), 2,0 mg/L 6-BA (d) und 3,0 mg/L 6-BA ( e) bzw. Pfeile zeigen auf somatische Embryonen. Alle Balken = 50 µm.

Es bestand ein signifikanter Unterschied zwischen der Kontrolle (6-BA fehlte im Kulturmedium) und den Behandlungen mit einigen spezifischen 6-BA-Konzentrationen (Abb. 6a – e). Es war nicht vorteilhaft für die ET-Proliferation, wenn die 6-BA-Konzentrationen zu hoch oder zu niedrig waren (Abb. 6). Mit dem Anstieg der 6-BA-Konzentrationen ausgehend von Null stieg die ET-Proliferationsrate zunächst an und nahm später ab. Die Zelllinie 2#04 wies eine höhere Proliferationsrate auf, wenn die 6-BA-Konzentration 2,0–3,0 mg/l betrug (Abb. 6a). Zelllinie 2#13 zeigte die höchste Proliferationsrate (721,0 ± 15 %), wenn 0,5 mg/L 6-BA ergänzt wurden (Abb. 6b); Zelllinie 1#16 hatte die höchste Proliferationsrate (520,0 ± 49,8 %), wenn die 6-BA-Konzentration 2,0 mg/L betrug (Abb. 6c), während Zelllinie 2#02 bessere Proliferationsraten erreichte, wenn die 6-BA-Konzentration zwischen 0,5 und 0,5 lag und 3,0 mg/L (Abb. 6d). Bei allen vier Zelllinien wurde die höchste ET-Proliferationsrate erreicht, wenn dem Kulturmedium 2,0 mg/L 6-BA zugesetzt wurde (Abb. 6e).

Auswirkungen von 6-BA-Konzentrationen, die im Gewebeproliferationsstadium ergänzt wurden, auf die ET-Proliferation und SE-Reifung bei verschiedenen Zelllinien in Blaufichte. Mittelwert ± SE, N = 5 für einzelne Linien oder 20 für alle vier Linien. Unterschiedliche Kleinbuchstaben weisen auf einen signifikanten Unterschied bei p ˂ 0,05 hin.

Bei einer 6-BA-Konzentration von 2,0 oder 3,0 mg/L zeigte die Zelllinie 2#04 höhere Proliferationsraten, wohingegen die SE-Reifungsfähigkeit schlecht war. Wenn 0,5 mg/L 6-BA ergänzt wurden, war die Fähigkeit zur SE-Reifung am besten (400 ± 83 reife SEs/g FW) (Abb. 6f). Bei der Zelllinie 2#13 war die Fähigkeit zur SE-Reifung am besten, wenn die 6-BA-Konzentration 1,0 mg/L betrug (320 ± 101 reife SE/g FW) (Abb. 6g); Für die Zelllinie 1#16 führten 2,0 mg/L 6-BA zur höchsten Proliferationsrate, wohingegen kein signifikanter Unterschied in der Fähigkeit der SE-Reifung beobachtet wurde (Abb. 6h); In der Zelllinie 2#02 wurde kein signifikanter Unterschied in der SE-Reifung festgestellt, wenn unterschiedliche 6-BA-Konzentrationen im Proliferationsstadium angewendet wurden (Abb. 6i).

Die Auswirkungen unterschiedlicher Saccharosekonzentrationen auf die Struktur/Morphologie von ET in den vier Zelllinien sind in Abb. 7 dargestellt. Bei einer Saccharosekonzentration von 5 oder 10 g/L war die Anzahl der frühen unreifen SEs im ET höher als die von Die anderen Konzentrationen und die morphologischen Eigenschaften der SEs sahen mit besser organisierten Strukturen besser aus (Abb. 7a, b). Wenn Saccharose auf 20 g/L erhöht wurde, verringerte sich die Anzahl der SEs im ET (Abb. 7c). Wenn 30 g/L Saccharose ergänzt wurden, nahm die Anzahl der SEs in ETs im Vergleich zu Abb. 7b und c deutlich ab (Abb. 7d).

Auswirkungen von Saccharosekonzentrationen auf die SE-Bildung in ET im Gewebeproliferationsstadium bei Blaufichten. (a–d) ET-Proliferationskultur, ergänzt mit 5 g/L Saccharose (a), 10 g/L Saccharose (b), 20 g/L Saccharose (c) bzw. 30 g/L Saccharose. Die Pfeile zeigen auf frühe unreife somatische Embryonen. Alle Balken = 50 µm.

In den Zelllinien 2#02 und 1#16 wurde ein signifikanter Unterschied in der ET-Proliferation zwischen den Behandlungen mit bestimmten Saccharosekonzentrationen festgestellt. In der Linie 2#02 wurde die bessere Gewebeproliferation mit den höheren Saccharosekonzentrationen erzielt (Abb. 8d), während es bei der Zelllinie 1#16 umgekehrt war (Abb. 8c). Zelllinie 2#04 hatte eine höhere ET-Proliferationsrate (412,6 ± 74,0 %), wenn 10 g/L Saccharose verwendet wurden (Abb. 8a), während sie bei Zelllinie 2#13 20 g/L Saccharose betrug (Abb. 8b). . Zelllinie 1#16 erreichte die höchste Proliferationsrate (413,4 ± 30,2 %), wenn 10 g/L Saccharose ergänzt wurden (Abb. 8c). Für die Zelllinie 2#02 waren die Proliferationsraten bei 10 bis 30 g/L Saccharose höher als bei 5 g/L Saccharose (Abb. 8d). Bei allen vier Zelllinien wurde die höchste ET-Proliferationsrate erreicht, wenn dem Kulturmedium 10 oder 20 mg/l Saccharose zugesetzt wurden (Abb. 8e). Signifikante Unterschiede in der SE-Reifung zwischen den Behandlungen mit bestimmten Saccharosekonzentrationen (Abb. 8f-i) konnten nur in den Zelllinien 2#04 (Abb. 8f) und 2#13 (Abb. 8g) festgestellt werden. Bei diesen beiden Linien verringerten die höheren Saccharosekonzentrationen die SE-Reifungsfähigkeit. Im Saccharosetest mit allen vier Zelllinien zusammen wurde kein signifikanter Unterschied festgestellt (Abb. 8j).

Auswirkungen von im Gewebeproliferationsstadium ergänzten Saccharosekonzentrationen auf die ET-Proliferation und SE-Reifung bei verschiedenen Zelllinien in Blaufichte. Mittelwert ± SE, N = 5 für einzelne Zeilen oder 20 für alle vier Zeilen, unterschiedliche Kleinbuchstaben zeigen einen signifikanten Unterschied bei p ˂ 0,05 an.

Pflanzenwachstumsregulatoren (PGRs) spielen bei verschiedenen Arten während des gesamten Prozesses der somatischen Embryogenese eine wichtige Rolle25,26,27,28, wie z. B. ET-Induktion (Phoenix dactylifera), ET-Proliferation (Pinus sibirica und Larix sibirica) und SE-Entwicklung/-Reifung (Medicago sativa)24,29,30. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, Einblicke in die möglichen Auswirkungen exogen angewendeter PGRs auf die somatische Embryogenese zu gewinnen. 2,4-D fungiert als Auxin und gilt als der wichtigste Regulator bei der ET-Induktion in Nadelbäumen31,32. In dieser Studie waren die ET-Proliferationsraten der vier Zelllinien alle niedrig, wenn 2,4-D im Kulturmedium fehlte, und auch die SE-Reifungsfähigkeit im folgenden Stadium war schlecht. Somit wurde bestätigt, dass die Ergänzung von 2,4-D für die ET-Proliferation essentiell ist. Signifikante Unterschiede wurden auch bei der SE-Reifung in bestimmten Zelllinien festgestellt. Als die 2,4-D-Konzentration 6,0 mg/L erreichte, nahm die Anzahl der frühen unreifen SEs in ET ab. Im SE-Reifungsstadium sank die Anzahl reifer SEs/g FW mit Ausnahme der Zelllinie 2#02 deutlich. Die Zelllinie 1#16 verlor sogar ihre Embryogenität. Diese zeigten, dass eine zu hohe 2,4-D-Konzentration entweder die ET-Proliferation oder die SE-Reifung negativ beeinflusst.

Viele Beweise haben gezeigt, dass die gleichzeitige Verwendung von Cytokinin und Auxin während der ET-Proliferation wirksamer ist als die einmalige Verwendung und dass diese beiden PGRs bis zu einem gewissen Grad synergistisch wirken, wie beispielsweise bei Acacia arabica33. Wenn in diesem Experiment 6-BA im Medium fehlte, waren die ET-Proliferationsrate und die SE-Reifungsfähigkeit in den vier Zelllinien geringer als bei zugesetztem 6-BA. Mit dem Anstieg der 6-BA-Konzentrationen stiegen die ET-Proliferationsraten allmählich an. Somit ist 6-BA für die ET-Proliferation notwendig, obwohl die SE-Reifungsfähigkeit keinen signifikanten Unterschied zeigte. Im Vergleich dazu zeigten 2,4-D-Konzentrationen einen größeren Einfluss auf die SE-Proliferationsrate als 6-BA. Wenn 6-BA 2,0 mg/L überstieg, verringerte sich die ET-Proliferationsrate in der Zelllinie 2#13. Wenn in der Zelllinie 1#16 6-BA 3,0 mg/L übersteigt, nahmen sowohl die Proliferationsrate als auch die SE-Reifungsfähigkeit ab. Alle Fakten zeigen, dass die optimale Konzentration von 6-BA eine wichtige Rolle spielt. Mittlerweile wurde in dieser Studie auch festgestellt, dass sowohl 2,4 D als auch BA die Proliferationsrate zwar beeinflussen, aber stark von der Zelllinie abhängig sind.

Bei Nadelbaumembryonen führten Saccharosekonzentrationen im Bereich von 1–3 % zu einer besseren Entwicklung34. Für einige Baumarten sind Glucose und Maltose bevorzugte Kohlenstoffquellen, zum Beispiel waren 2 % Maltose für die ET-Induktion besser als 2 % Saccharose in Pinus nigra35. Hohe Saccharosekonzentrationen könnten eine Zellplasmolyse verursachen und dadurch zu Dehydrierung und zum Absterben von Zellen mit geringer Resistenz führen36. In dieser Studie waren die Reaktionen auf Saccharose verschiedener Konzentrationen in den vier Zelllinien unterschiedlich. Bei einem Saccharosegehalt von 10 g/L waren die ET-Proliferationsraten in allen vier Zelllinien höher als bei anderen Konzentrationen. Wenn Saccharose im Bereich von 5–30 g/L lag, unterschied sich die SE-Reifungsfähigkeit weder in den Zelllinien 1#16 noch 2#02 signifikant. Als die Saccharosekonzentration auf bis zu 30 g/L anstieg, nahm die SE-Reifungsfähigkeit der Zelllinien 2#04 und 2#13 ab. Allerdings konnte bei allen Behandlungen mit Saccharosekonzentrationen eine gewisse Anzahl früher unreifer SEs beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass die Saccharosekonzentration nicht der Hauptfaktor für die Förderung früher SEs war. Die Anzahl der frühen SEs in ET nahm ab, als die Saccharose einen Wert von 30 g/L erreichte, was möglicherweise auf das hohe osmotische Potenzial der Kultur zurückzuführen ist, was zu einer schlechten ET-Proliferation führte.

In dieser Studie gab es signifikante Unterschiede in der ET-Induktion zwischen den beiden in dieser Forschung verwendeten Provenienzen und die höchste Induktionsrate betrug 78,8 % ± 12,5 % (F2), die niedrigste lag bei 62,50 ± 12,8 % (F1). Da das Protokoll der ET-Induktion im Vergleich zum vorherigen1 nicht wesentlich geändert wurde, können die viel höheren Induktionsraten in dieser Untersuchung auf die unterschiedlichen Explantatquellen und/oder die bessere Funktionsweise im Detail zurückzuführen sein.

Es könnte erwähnt werden, dass die Proliferation von ET nicht immer mit der SE-Reifung übereinstimmt. Bei der Auswertung der angegebenen Parameter mit den vier einzelnen Zelllinien werden die Unterschiede zwischen ihnen deutlich. Es ist allgemein bekannt, dass das gewünschte Protokoll der somatischen Embryogenese für alle Zelllinien geeignet sein sollte. In der Praxis konnte jedoch kein solches Protokoll entwickelt werden. Tatsächlich wird ein Protokoll ausgewählt, das für die meisten Zelllinien geeignet ist, um die Kosten zu senken. Diese Untersuchung ergab, dass zwischen den Kulturen, die jeweils zu den einzelnen Linien passen, ein bemerkenswerter Unterschied besteht. Daher wird für Elite-Zelllinien, beispielsweise Linien mit hohem genetischem Gewinn, die Entwicklung eines Protokolls auf der Grundlage von Genotyp-Antworten dringend empfohlen, wenn das allgemeine Kulturprotokoll für bestimmte Zelllinien, die in der Praxis wesentlich sind, nicht ordnungsgemäß funktioniert. Den Ergebnissen dieser Untersuchung zufolge war das allgemeine Kulturmedium für die ET-Proliferation für alle Zelllinien mLV als Basismedium, ergänzt mit 2,0 mg/L 2,4-D, 2 mg/L 6-BA, 10 g/L Saccharose , 0,8 g/L Caseinhydrolysat, 0,5 g/L L-Glutamin und 4 g/L Gelrite, während bei Sun und Jia4 1/2LM-Medium als Basismedium verwendet wurde, ergänzt mit 1,0 mg/L 2,4-D, 0,5 mg/L 6-BA, 0,5 mg/L KT und die höchste embryonale Kallusproliferationsrate betrug 102,27 %. Bei Tao et al.1 war es 1/2LM ergänzt mit 6,25 µM (1,38 mg/L) 2,4- D, 3,75 µM (0,84 mg/L) BA für Flüssigkulturen und 7,5 µM (1,69 mg/L) BA, 12,5 µM (2,76 mg/L) 2,4-D für feste Kulturen und die höchste Proliferationsrate von embryonalem Kallus betrug 179,1 %. Mit dem optimierten Protokoll in dieser Studie könnte die ET-Proliferationsrate auf bis zu 1473,7 ± 556,0 % steigen. Darüber hinaus wurden in früheren Studien die Kulturbedingungen der ET-Proliferation und der SE-Reifung oft getrennt betrachtet. Über den Einfluss der Kulturen, also der vorherigen Kulturstufe auf die folgende, wurden nur wenige Studien berichtet. Diese Studie ergab, dass die Kulturkomponenten im ET-Proliferationsstadium nicht nur die ET-Proliferation beeinflussten, sondern auch die SE-Reifung im folgenden Stadium durch die spezifischen Konzentrationen von 2,4-D und 6-BA beeinflussten, was in früheren Studien nicht berichtet wurde in Blaufichte.

Daten und Materialien der aktuellen Studie sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Alle während dieser Studie generierten und/oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

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Wir möchten Dr. Rongzhou Man (Ontario Forestry Research Institute, Kanada) und Dr. Yuhui Weng (Arthur Temple College of Forestry and Agriculture, Stephen F. Austin State University, USA) für ihre Beratung und Hilfe bei diesem Dokument danken.

Diese Forschung wird durch das große Wissenschafts- und Technologieprojekt „Forschung zu Sammlungs- und Konservierungstechnologien von Keimplasma-Ressourcen in den Bäumen des Changbai-Berges“ der Forstwirtschaft der Provinz Jilin (2015-002), das Projekt zur Förderung und Demonstration von Forstwissenschaft und -technologie, unterstützt. „Promotion of Efficient Propagation Technologies in Blue Spruce“, finanziert von der Central Finance of China (Nr. JLT2021-10).

Jilin Provincial Academy of Forestry Sciences, 3528 Linhe St., Changchun, 130033, Jilin, China

Fang Gao, Xi Cao, Caiyun Qin, Shigang Chen, Jufeng Cai und Jing Tao

Hochschule für Gartenbau der Jilin Agricultural University, 2888 Xincheng St., Changchun, 130118, Jilin, China

Xi Cao

Changchun Academy of Forestry, 5840 Jingyue St., Changchun, 130117, Jilin, China

Changbin Sun

Zentrum für Waldbiologie, Fachbereich Biologie, University of Victoria, Victoria, BC, V8W 3N5, Kanada

Lisheng Kong

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Konzeptualisierung, JT; Formale Analyse, FG und XC; Finanzierungseinwerbung, JT; Untersuchung, FG, XC, CQ, SC, JC und CS; Aufsicht, JT; Schreiben – Originalentwurf, FG, XC, CQ, SC und JC; Schreiben – Rezension und Bearbeitung, LK und JT

Korrespondenz mit Jing Tao.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Gao, F., Cao, X., Qin, C. et al. Auswirkungen von Pflanzenwachstumsregulatoren und Saccharose auf die Proliferation und Qualität von embryogenem Gewebe in Picea pungens. Sci Rep 13, 13194 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39389-8

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Eingegangen: 3. April 2023

Angenommen: 25. Juli 2023

Veröffentlicht: 14. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39389-8

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